Principes de biologie moléculaire en biologie clinique
Nedjma Ameziane, Marc Bogard, Jérôme Lamoril
Elsevier
PréfaceVII
Partie I. Bases fondamentales1
1 Généralités3
Structure des acides nucléiques3
Code génétique5
Description générale du génome humain5
Réplication14
Du génotype au phénotype : l'expression d'un gène16
Annexe33
2 Bases de pathologie moléculaire35
Génétique mendélienne35
Génétique non mendélienne41
Mutations mitochondriales43
Anomalies d'empreintes génomiques44
Polymorphismes45
Gènes de susceptibilité - Modulation polygénique des maladies monogéniques48
Gènes modificateurs49
Maladies polygéniques et multifactorielles49
Pathologie moléculaire : les mutations50
Généralités sur les effets des mutations63
Relation génotype-phénotype66
Mutation(s) et pathologie68
Mutation(s) et pathologie73
Nomenclature des variations de séquence73
Partie II. Les outils utilisés en biologie moléculaire81
3 Enzymes de restriction-modification83
Enzymes de restriction84
Méthyltransférases99
Conclusion105
4 Polymérases107
ADN polymérases107
ARN polymérases123
Transcriptases inverses125
Conclusion126
ADN polymérases et réparation de l'ADN126
5 Enzymes de modification131
Nucléases131
Phosphatases alcalines137
Kinases138
Transférase terminale138
Enzymes intervenant dans la réparation de l'ADN138
Enzymes et produits divers150
Conclusion153
6 Séparation des acides nucléiques155
Électrophorèse155
Méthodes de capture167
Conclusion170
7 Synthèse des oligonucléotides173
Éléments constitutifs de la synthèse d'oligonucléotides173
Synthèse proprement dite174
Caractéristiques physicochimiques des oligonucléotides188
8 Hybridation moléculaire195
Fusion de l'ADN195
Obtention et marquage des sondes199
Hybridation proprement dite209
Détection des hybrides marqués par des sondes210
Applications211
Conclusion211
9 Extraction-purification de l'ADN et de l'ARN215
Recueil du spécimen216
Extraction des acides nucléiques216
Automatisation de l'extraction-purification225
Conclusion226
Partie III. Amplification génique229
10 Polymerase chain reaction et autres systèmes d'amplification231
Limites de l'identification de séquences nucléiques par hybridation moléculaire231
Définition de l'amplification génique232
Amplification de cibles : la polymerase chain reaction
232
Amplification par PCR « classique »232
Amplification par PCR en temps réel251
PCR quantitative265
Techniques alternatives d'amplification
285
Amplification par processus transcriptionnel : TMA, NASBA et 3SR285
Amplification par déplacement de brin (SDA)287
Techniques d'amplification basées sur la rolling circle amplification289
Ligase chain reaction
290
Cycling probe reaction
292
ADN branché ou branched DNA (bDNA)293
Système Hybrid capture®294
Systèmes anticontamination
296
Méthodes physiques d'isolement297
Destruction de l'ADN contaminant avant introduction de la cible297
Modification des amplicons afin de les différencier de la cible298
Application des méthodes anticontaminations aux autres procédés d'amplification303
Mise en place d'un système de prévention des contaminations303
Partie IV. Principales techniques de détection des mutations309
11 Techniques de criblage (screening) des mutations311
Électrophorèse en gradient de gel dénaturant311
Chromatographie liquide haute performance en milieu dénaturant314
Polymorphisme de conformation simple brin (single strand conformation polymorphism, SSCP)315
Analyse d'hétéroduplex (heteroduplex analysis, HA ou heteroduplex mobility assay, HMA)317
Transcription-traduction en protéine (protein transcription translation assay, PTT)318
Technique CFLPTM (Cleavase®fragment length polymorphism)320
Clivage chimique des mésappariements (chemical clivage mismatch, CCM)321
Technique d'empreinte par didéoxynucléotides (dideoxy-fingerprinting, ddF)322
Système BESS-T>M Base Readers (BESS MutaScanTM ; base excision sequence scanning, BESS)323
Étude de l'ARN après protection contre les RNAses, le système NIRCATM324
PCR multiplex325
Southern blot327
12 Techniques de détection des mutations connues333
Techniques d'hybridation à l'aide d'oligonucléotides spécifiques d'allèle (allele specific oligonucleotides, ASO) : dot/slot-blot et reverse dot-blot333
Extension d'amorce ou miniséquençage335
PCR spécifique d'allèle336
Système de génotypage READITTM SNP338
Principe338
Digestion enzymatique (Southern blot et PCR-RFLP)339
Détection par acides nucléiques peptides (peptide nucleic acid, PNA)340
Technique de ligature des oligonucléotides (oligonucleotide ligation assay, OLA)341
Techniques de PCR en temps réel343
Détection par acides nucléiques verrouillés (locked nucleic acid, LNA)345
RCA (rolling circle amplification)346
Technique de clivage invasif : InvaderTM349
Techniques de génotypage à partir de pool d'ADN (pooling DNA)350
Technique de référence : le séquençage351
Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)351
Principe351
Avantages351
Inconvénients353
Applications353
Variante de MLPA354
Applications354
13 Techniques de mise en évidence indirecte de mutations359
Analyse de microsatellites359
Longue PCR (long PCR)362
14 Étude des modifications épigénétiques365
Introduction365
Techniques utilisées pour l'étude de la méthylation de l'ADN367
DHPLC371
15 Autres techniques375
Spectrométrie de masse375
Puces à ADN379
Pyroséquençage387
Partie V. Le séquençage des acides nucléiques401
16 Techniques de séquençage de l'ADN403
Méthode de Sanger403
Séquençage avec la méthode de Maxam et Gilbert410
Séquençage par hybridation ou sequencing by hybridization (SBH)410
Mini-séquençage luminométrique en temps réel ou pyrosequencing412
Autres méthodes de séquençage415
Partie VI. Les stratégies de détection des mutations417
17 Approche générale419
Principes généraux419
Techniques d'analyse moléculaire de l'ADN423
Techniques d'analyse moléculaire de l'ARN424
Quantification des acides nucléiques425
Que choisir ?426
Droit et biologie moléculaire426
Partie VII. Principaux outils d'étude de la fonction des gènes431
18 Principales méthodes d'exploration de la fonction des gènes433
Principes du sous-clonage433
Introduction aux vecteurs d'expression436
Transcription/traduction in vitro446
Mutagenèse in vitro448
Étude de la fonctionnalité des gènes par interférence d'ARN449
Retardement sur gel452
Empreinte ADN ou DNase I footprinting454
Protection de la ribonucléase454
Sensibilité aux nucléases S1457
Amplification rapide des extrémités d'ADNc457
Mesure de la demi-vie de l'ARNm458
Partie VIII. Le laboratoire de biologie moléculaire461
19 Organisation d'un laboratoire de biologie moléculaire463
Problème des contaminations464
Maîtrise des risques de contamination465
Équipement du laboratoire467
Entretien et précaution469
Évolutions récentes et à venir470
Partie IX. Les domaines d'application en biologie moléculaire473
20 Principales applications de la biologie moléculaire475
Considérations générales475
Recherche et analyse de génome étranger : la microbiologie476
Analyse du génome humain478
Diagnostic prénatal485
Diagnostic préimplantatoire489
Résultats du DPI492
Avantages et inconvénients du DPI494
Aspects juridiques en France494
Éthique générale en biologie moléculaire495
Annexe : la législation en France501
Partie X. Thérapie génique503
21 Principes généraux de la thérapie génique505
Généralités sur la thérapie génique506
Méthodes de transferts de matériel génétique506
Applications de la thérapie génique527
Thérapie génique et réglementations532
Pharmacologie et traitement du gène532
Thérapie génique naturelle - Mutations inverses535
Partie XI. Nouvelles stratégies541
22 Puces à ADN ou micro-array543
Puce à ADN ou micro-array543
Exemple de puces : GeneChip® Affymetrix552
Amélioration des techniques relatives aux puces et arrays558
Applications562
Conclusion570
23 Protéomique573
Définition574
Analyse par protéomique574
Applications583
Informatique et protéomique585
Conclusion585
24 ARN interférence589
Rappel sur l'inactivation des ARN messagers chez les mammifères589
Découverte du phénomène d'ARN interférence591
Mécanisme de l'ARN interférence591
ARN interférence et génome592
Intérêt de l'ARN interférence en génomique593
L'ARN interférence en pratique594
Applications603
Conclusion605
25 Micro-ARN609
Origine et mécanisme des micro-ARN610
Localisation des gènes codant pour les miARN611
Fonction des micros ARN611
Analyse des miARN613
Conclusion616
Partie XII. Principes du clonage619
26 Introduction à la transgenèse et au clonage621
Principes de transgenèse621
Techniques de transfert de gènes628
Expression des transgènes629
Introduction au clonage des mammifères par transfert de noyau dans des cellules somatiques630
La parthénogenèse, une alternative au clonage636
Annexe : les textes de loi en France639
Sites internet de biologie moléculaire641
27 Sites internet643
28 Rebase® http://rebase.neb.com/655
Rebase® : caractéristiques générales655
Le site Rebase®656
Conclusion670
Postface673
La biologie moléculaire, une nouvelle spécialité en biologie médicale ?675
Doit-on changer la formation du biologiste en biologie moléculaire ?676
Étude du génome humain et des génomes étrangers en médecine humaine676
Propositions pour la génétique moléculaire676
Biologie moléculaire et société677
Glossaire679
Index699