Appareils et méthodes en biochimie et biologie moléculaire
Bernard Hainque
Bruno Baudin
Philippe Lefebvre
Flammarion
Avant-propos, par B. Baudin, B. Hainque et Ph. LefebvreXVII
Méthodes générales
Chapitre 1. Unités, instrumentation et métrologie, par B. Baudin, P. Kamoun et N. Mario3
Unités3
Unités de base3
Unités dérivées3
Unités d'électricité usuelles5
Utilisation des gaz5
Commercialisation des gaz5
Utilisation des gaz5
Production de vide8
Trompes à vide8
Pompes à vide8
Production de chaleur8
Combustion d'un gaz8
Chauffage d'une résistance électrique9
Autres modes de chauffage11
Production de froid et lyophilisation11
Réfrigérateurs et congélateurs11
Neige carbonique et azote liquide11
Lyophilisation11
Volumétrie et matériel courant de laboratoire12
Matériel de volumétrie12
Matériel courant au laboratoire14
Balances15
Caractéristiques des balances et différents types15
Dosages gravimétriques16
Chapitre 2. Préparation des réactifs, par B. Baudin, P. Kamoun et N. Mario17
Purification de l'eau17
Eau de ville17
Les différents types d'eau purifiée17
Conservation et utilisation des eaux purifiées18
Mesure du pH et solutions tampons18
Mesure du pH18
Étalonnage et solutions d'étalonnage20
Solutions tampons21
Produits et réactifs chimiques24
Produits chimiques24
Préparation des solutions24
Osmolalité d'une solution tampon26
Bioréactifs27
Principes de marquage et méthodes quantitatives27
Méthodes qualitatives et amplification du signal28
Chapitre 3 Préparation des échantillons biologiques, par B. Baudin et N. Mario30
Sang30
Modes de prélèvement30
Conditions de prélèvement30
Utilisation du prélèvement30
Anticoagulants31
Conservation31
Interférences31
Urines32
Autres liquides biologiques32
Tissus32
Chapitre 4. Méthodes d'extraction et de fractionnement, par B. Baudin, D. Bonnefont-Rousselot, P. Kamoun et D. Sternberg34
Précipitations et extractions sélectives34
Précipitation des protéines34
Extraction des protéines membranaires35
Extraction des acides nucléiques35
Dialyse40
Membranes de dialyse40
Facteurs influençant la dialyse40
Méthodes de dialyse41
Applications de la dialyse42
Filtration42
Principes42
Procédés de filtration42
Différents types de filtres43
Ultrafiltration44
Centrifugation et ultracentrifugation45
Définitions45
Principes de la centrifugation45
Appareillages46
Ultracentrifugation préparative47
Applications de la centrifugation en biochimie et biologie moléculaire49
Chapitre 5. Bonnes pratiques de laboratoire, par N. Mario50
Notions générales50
Définition de la qualité50
Réglementation50
Procédures51
Phase pré-analytique51
Prélèvement des échantillons51
Conservation et transport des échantillons51
Réception et enregistrement des échantillons52
Phase analytique52
Instrumentation et réactifs52
Validation d'une méthode d'analyse quantitative (dosage)52
Contrôle de qualité55
Phase post-analytique56
Méthodes d'identification et de dosage des biomolécules
Chapitre 6. Méthodes spectroscopiques, par D. Fompeydie et Ph. Lefebvre59
Propriétés de la lumière, par Ph. Lefebvre59
Nature de la lumière59
Différents domaines des ondes électromagnétiques60
Diffraction de la lumière60
Réflexion et réfraction de la lumière61
Diffusion de la lumière62
Spectrophotométrie d'absorption moléculaire, par Ph. Lefebvre62
Émission de rayonnements62
Absorption de la lumière63
Appareillage64
Spectrophotométrie dérivée, par D. Fompeydie78
Principe de la méthode78
Aspect des courbes78
Conséquences78
Appareillage79
Intérêt de la dérivation79
Applications80
Photométrie des milieux troubles : turbidimétrie et néphélométrie, par D. Fompeydie et Ph. Lefebvre81
Principe81
Appareillage81
Applications81
Chapitre 7. Spectroscopie moléculaire par luminescence, par N. Auzeil et A. Regazzetti83
Généralités. Principes de la fluorescence83
Excitation de la molécule par absorption d'un photon84
Devenir d'une molécule excitée84
Signal de fluorescence85
Grandeurs caractéristiques du processus de fluorescence86
Disparition de la fluorescence90
Phénomènes liés à la fluorescence93
Anisotropie et polarisation de fluorescence93
Fluorescence par transfert d'énergie par résonance (FRET)95
Spectrofluorimétrie96
Spectrofluorimètres97
Recommandations pour les analyses effectuées par spectrofluorimétrie98
Molécules fluorescentes99
Généralités99
Fluorophores intrinsèques99
Fluorophores extrinsèques100
Quelques applications de la fluorescence109
Applications biochimiques de la polarisation de fluorescence109
Détection et dosage par CLHP couplée à une détection par fluorescence111
Chimiluminescence et bioluminescence111
Chimiluminescence111
Bioluminescence114
Applications115
Chapitre 8. Spectrométries d'absorption et d'émission atomiques, par J. Poupon120
Principe général120
Aspects théoriques et appareillage120
Atome et théorie quantique120
Spectrométrie d'absorption atomique en flamme (SAAF)122
Spectrométrie d'absorption atomique électrothermique (SAAET)123
Spectrométrie d'émission atomique en flamme (photométrie de flamme)127
Spectrométrie d'émission atomique en plasma couplé induit haute fréquence (ICP-OES)127
Couplages et spéciation129
Chapitre 9. Spectrométrie de masse130
Introduction générale et définitions, par M.-C. Menet130
Spectromètre de masse130
Spectre de masse131
Masse131
Exactitude de masse132
Résolution132
Sensibilité132
Limite de masse132
Ions132
Analyse des molécules organiques : biomolécules simples et macromolécules, par M.-C. Menet132
Principes et appareillages132
Couplage des méthodes séparatives avec la spectrométrie de masse144
Applications144
Analyse des molécules inorganiques et des éléments minéraux par spectrométrie de masse en plasma induit, par J. Poupon153
Principes et appareillages153
Interférences en ICP-MS et systèmes de correction des interférences154
Applications156
Chapitre 10. Méthodes électrochimiques et potentiométriques, par A. Dugay158
Méthodes électrochimiques158
Voltamétrie ou voltampérométrie158
Potentiométrie, ampérométrie et coulométrie161
Applications des méthodes électrochimiques163
Méthodes potentiométriques166
Électrodes indicatrices métalliques166
Électrodes indicatrices à membrane sélective ou électrodes spécifiques168
Méthodes de calcul de la concentration176
Applications de la potentiométrie en biochimie clinique177
Chapitre 11. Méthodes isotopiques, par P. Kamoun et J.-M. Villette180
Structure de l'atome180
Radioactivité180
Émission alpha (alpha)180
Émission bêta (bêta)180
Émission gamma (gamma)181
Lois de la radioactivité181
Détection et mesure de la radioactivité182
Chapitre 12. Méthodes enzymatiques, par B. Baudin187
Définition des enzymes et spécificité187
Spécificité187
Site actif187
Mécanismes de la catalyse187
Aspects cinétiques188
Relation de Michaelis-Menten et inhibiteurs enzymatiques189
Enzymes allostériques191
Classification des enzymes et principales coenzymes192
Détermination des activités enzymatiques194
Dosage de substrats par des méthodes enzymatiques196
Enzymes-réactifs de laboratoire198
Marquage des enzymes pour immunodosage198
Biocapteurs enzymatiques199
Autres emplois des enzymes199
Purification des enzymes199
Chapitre 13. Méthodes immunologiques, par J.-M. Bidart et L. Lacroix201
Principes généraux201
Anticorps et antigène201
Réaction antigène-anticorps202
Production des anticorps202
Production et caractéristiques des anticorps polyclonaux202
Production et caractéristiques des anticorps monoclonaux203
Ingénierie des anticorps204
Principales méthodes immunologiques205
Méthodes fondées sur la précipitation ou l'agglutination205
Méthodes fondées sur l'utilisation de réactifs marqués206
Vers des méthodes immunologiques sans anticorps212
Méthodes multiplex212
De la sensibilité des immunodosages213
De la modification des anticorps à leur substitution par des aptamères214
Chapitre 14. Méthodes chromatographiques : généralités, par Ph. Lefebvre216
Différents types de chromatographies216
Chromatographie planaire216
Chromatographie en phase gazeuse216
Chromatographie en phase liquide216
Principaux mécanismes de séparation chromatographique216
Chromatographie d'adsorption216
Chromatographie de partage217
Chromatographie d'échange d'ions217
Chromatographie d'exclusion stérique217
Chromatographie d'affinité217
Principales données théoriques217
Coefficient de partage217
Grandeurs de rétention218
Efficacité de la colonne218
Qualité de la séparation219
Chapitre 15. Chromatographie planaire, par Ph. Lefebvre221
Chromatographie sur papier221
Chromatographie sur couches minces221
Principe221
Mécanismes de séparation221
Conduite d'une CCM222
Grandeurs caractéristiques224
Chapitre 16. Chromatographie en phase gazeuse, par J.-P. Gramond et Ph. Lefebvre226
Principes de la séparation226
Interactions moléculaires dispersives226
Interactions moléculaires polaires226
Appareillage226
Gaz vecteur226
Colonne227
Modes d'injection229
Détection235
Préparation de l'échantillon237
Extraction237
Dérivation237
Optimisation de l'analyse237
Choix du gaz vecteur237
Température d'analyse238
Anomalies rencontrées lors de l'acquisition d'un chromatogramme238
Quantification : méthode de l'étalonnage interne238
Chapitre 17. Chromatographie liquide à haute performance240
Interactions moléculaires, par M.-C. Menet240
Moment dipolaire241
Interactions241
Évaluation de la polarité d'une molécule organique241
Évaluation de l'hydrophobie d'une molécule organique242
Couples phase stationnaire/phase mobile. Mécanismes de rétention, par M.-C. Menet242
Chromatographie d'adsorption242
Chromatographie de partage243
Chromatographie d'échange d'ions245
Chromatographie d'exclusion stérique247
Séparation des molécules chirales249
Optimisation en chromatographie en phase liquide, par M.-C. Menet251
Augmentation de la résolution par modification du facteur de rétention k(...)251
Augmentation de la résolution par augmentation de la sélectivité alpha252
Augmentation de la résolution par augmentation de l'efficacité N252
Appareillage en chromatographie liquide, par P. Lefebvre et M.-C. Menet254
Pompes254
Systèmes d'injection257
Colonnes257
Détecteurs258
Chapitre 18. Dérivation en chromatographie, par Ph. Lefebvre262
Dérivation en chromatographie en phase gazeuse262
Réactions de silylation262
Réactions d'acylation264
Réactions d'alkylation266
Dérivation en chromatographie liquide à haute performance266
Dérivation pour l'extraction266
Dérivation pour la séparation267
Dérivation pour la détection270
Dérivation pré- ou post-colonne271
Chapitre 19. Méthodes électrophorétiques, par B. Baudin274
Principes généraux de l'électrophorèse274
Mobilité électrophorétique et facteurs influants274
Courants électro-osmotiques et effet Joule275
Électrophorèse de zone275
Définition et ionisation des macromolécules biologiques275
Caractéristiques276
Supports276
Méthodologies en électrophorèse de zone277
Méthodes de révélation282
Électrophorèse préparative284
Électrophorèse préparative sur gel284
Électrophorèse préparative sur colonne284
Électrophorèse à écoulement libre ou free flow electrophoresis285
Électrophorèse en veine liquide et électrophorèse capillaire285
Principes et avantages de l'électrophorèse capillaire285
Principales méthodes utilisées en électrophorèse capillaire286
Appareils288
Méthodes d'étude des macromolécules
Chapitre 20. Purification des macromolécules par chromatographie liquide, par B. Baudin291
Matériels291
Colonnes291
Pompes292
Détecteurs292
Collecte des fractions et traitement du signal292
Aspects quantitatifs293
Chromatographie d'exclusion stérique293
Principe293
Colonnes d'exclusion stérique et tampons de travail293
Applications préparatives aux macromolécules294
Chromatographie d'échange d'ions296
Principe général296
Application aux protéines296
Application aux acides nucléiques et autres molécules biologiques297
Colonnes et tampons de travail297
Chromatographies d'adsorption et de partage298
Chromatographie sur hydroxyapatite298
Chromatographie sur colorants chimiques298
Chromatographie sur chélates métalliques ou immobilized metal affinity chromatography298
Chromatographie d'interactions hydrophobes299
Chromatographie en phases inversées300
Chromatographie d'affinité300
Affinité chimique300
Affinité biologique301
Chapitre 21. Méthodes d'étude structurale des macromolécules, par B. Baudin, F. Dardel et D. Sternberg303
Purification et dosage des protéines, par B. Baudin303
Purification des protéines303
Dosage des protéines304
Quantification de l'ADN et l'ARN, par D. Sternberg306
Purification des acides nucléiques306
Dosage de l'ADN et de l'ARN306
Étude de la structure primaire, par B. Baudin, avec D. Sternberg308
Composition chimique des protéines et peptides308
Détermination de la séquence309
Détermination de la masse, de la taille et de la forme, par B. Baudin314
Notions de masse moléculaire, de forme et de taille314
Méthodes d'étude directes et méthodes biochimiques314
Analyses de sédimentation par ultracentrifugation315
Méthodes utilisant la diffusion de la lumière317
Méthodes d'analyse des structures secondaire et tertiaire317
Rappel sur les différents niveaux structuraux des macromolécules, par B. Baudin317
Dichroïsme circulaire appliqué à l'étude des protéines, par B. Baudin318
Études par radiocristallographie et RMN-2D, par F. Dardel319
Méthodes d'étude en biologie moléculaire
Chapitre 22. Principes, méthodes et outils en biologie moléculaire, par D. Sternberg329
L'hybridation, propriété fondamentale des acides nucléiques330
Forces à l'origine de l'appariement en double hélice330
Facteurs de transition entre état apparié et état non apparié330
Notion de température de fusion (Tm) et de courbe de fusion330
Méthodes de caractérisation du génome ou du transcriptome fondées sur la reconnaissance par hybridation332
Outils enzymatiques de modification et de synthèse des acides nucléiques334
Introduction et revue générale334
Endonucléases de restriction de l'ADN double brin335
Propriétés des ADN polymérases utilisant des matrices ADN et ARN335
Méthodes d'étude de l'ARN utilisant la synthèse d'ADN à partir d'ARN (transcription inverse)336
Introduction générale336
Types d'amorçage pour la RT (synthèse des brins antisens)337
Transcriptases inverses utilisables pour la RT338
Méthodes utilisées pour la synthèse du second brin (si nécessaire)338
Problème de la représentativité qualitative et quantitative du produit final de RT éventuellement amplifié339
Méthodes de polymérisation en chaîne de l'ADN (PCR)339
Présentation générale de la réaction339
Historique de la PCR340
Cinétiques théorique et réelle de la synthèse d'ADN au cours de la PCR341
Variétés des réactifs et des conditions réactionnelles en PCR341
Échantillons d'ADN ou d'ARN introduits dans le mélange réactionnel de la PCR343
Utilisation de standards dans une PCR344
Les conditions thermiques de la réaction de PCR et leur contrôle344
Optimisation d'une PCR345
Quantification du nombre de copies d'une séquence d'acide nucléique par (RT-)PCR en temps réel345
Dispositifs moléculaires d'émission de fluorescence utilisés346
Normalisation par rapport à un fluorochrome passif348
Modes d'expression des mesures348
Gamme dynamique et efficacité348
(RT-)PCR quantitative avec standard endogène et méthode des deltadeltaCt349
Méthodes de détection de mutations ponctuelles de l'ADN350
Méthode fondée sur la détection des polymorphismes de restriction (RFLP)350
Étude des polymorphismes conformationnels des simples brins par SSCP351
Méthodes fondées sur la détection des hétéroduplex ou des mésappariements353
Électrophorèse sur gel en gradient de dénaturation (DGGE)353
Chromatographie liquide à haute performance en conditions de dénaturation (DHPLC)358
Chapitre 23. Aperçus sur le clonage de l'ADN, par D. Sternberg362
Les quatre étapes du clonage362
Génération des fragments d'ADN : étape 1362
Choix et préparation du vecteur, et jonction de l'ADN d'intérêt à l'ADN vecteur : étape 2362
Introduction de l'ADN vecteur greffé dans les cellules hôtes : étape 3362
Criblage des cellules hôtes ayant incorporé le vecteur greffé : étape 4364
Quelques vecteurs de clonage365
Contraintes concernant l'ADN insérable365
Plasmides bactériens sauvages366
Phages367
Systèmes hybrides369
Conclusion371
Chapitre 24. Puces à ADN. Méthodes d'étude du génome et du transcriptome, par J.-M. Bidart et L. Lacroix372
Principe général373
Les différents types de puces à ADN375
Densité375
Support375
Système de détection376
Type de séquences utilisées comme sondes377
Fabrication des puces à ADN378
Préparation des échantillons, amplification, marquage et hybridation des cibles378
Préparation des échantillons d'acides nucléiques378
Amplification et marquage des cibles378
Hybridation et lavage378
Analyse bio-informatique et biostatistique379
Acquisition des images379
Normalisation, filtrage et représentation des données379
Analyse biostatistique des données d'expression génique380
Conclusion382
Exemple d'application383
Méthodes d'étude des interactions moléculaires
Chapitre 25. Interactions ligands-récepteurs, par B. Baudin et B. Hainque387
Classification des interactions moléculaires387
Principes de caractérisation des liaisons ligand-site récepteur387
Méthodes expérimentales389
Méthodes ne modifiant pas l'équilibre389
Méthodes susceptibles de modifier l'équilibre389
Analyse des interactions en temps réel389
Mise en évidence de résidus fonctionnels et de zones d'interactions390
Méthodes physiques390
Méthodes chimiques392
Méthodes biologiques394
Étude des complexes protéiques395
Méthodes d'étude des interactions protéine-protéine in vivo395
Méthodes d'étude des interactions protéine-protéine in vitro406
Chapitre 26. Interactions acides nucléiques-protéines, par B. Hainque408
Diversité des objectifs et des approches méthodologiques408
Place des méthodes de purification dans l'étude des interactions acides nucléiques-protéines409
Place des méthodes de clonage dans l'étude des interactions acides nucléiques-protéines410
Détermination des caractéristiques des interactions acides nucléiques-protéines411
Méthodes d'étude des interactions ADN-protéines412
Filtration sur membrane de nitrocellulose412
Retardement sur gel412
Balises moléculaires et FRET ou BRET414
Empreinte in vitro (protection de l'ADN vis-à-vis de réactifs de clivage, enzymatiques ou chimiques)415
Interférence par modification de nucléotides419
Formation de liaisons covalentes ADN-protéines par irradiation UV420
Empreinte in vivo par méthylation des purines421
Identification des protéines de liaison à l'ADN par le système simple hybride422
Identification des motifs nucléotidiques par sélection itérative et amplification par PCR des sites de liaison à partir d'un pool d'oligonucléotides de séquence variable424
Exploration de la localisation génomique des protéines associées in vivo à la chromatine par immunoprécipitation425
Méthodes d'étude des interactions ARN-protéines427
Retardement sur gel427
Empreinte in vitro (protection de l'ARN vis-à-vis de réactifs de clivage chimiques)427
Formation de liaisons covalentes ARN-protéines par irradiation UV428
Reconstitution in vitro et purification des complexes ARN-protéines429
Identification des protéines de liaison aux ARN par le système triple hybride429
Sélection in vitro des ARN fonctionnels431
L'essor de nouvelles méthodes431
Liste des abréviations433
Index437