Fondamentaux d'optique et d'imagerie numérique à l'usage des microscopistes
Christian Cibert
Cépaduès-Éditions
1 Avant-propos
15
1.1 Doit-on croire ce que l'on voit ?
15
1.2 Au fil des pages
16
1.3 Bibliographie
17
2 Lumière et optique
19
2.1 Le principe de Fermat
19
2.2 Loi de la réfraction de Snell-Descartes
21
2.3 Lois de la réflexion, réflexion totale
23
2.4 Lumière = ondes et/ou flux de particules ?
25
3 Formation des images
31
3.1 Approximation de Gauss
31
3.2 Vergence, distances focales et foyers
32
3.2.1 Vergence32
3.2.2 Distances focales d'un système centré35
3.2.3 Foyers et plans focaux d'un système centré35
3.3 Grandissement et grossissement
35
3.3.1 Grandissements d'un système centré36
3.3.2 Grossissement d'un système centré37
3.3.3 Plans principaux et distances focales37
3.4 Stigmatisme
38
3.5 Ouverture numérique d'un système centré
42
3.6 Diaphragmes d'un microscope
43
4 Résolution spatiale
45
4.1 Image réelle d'une source ponctuelle
45
4.2 Résolution théorique d'un microscope photonique
48
4.2.1 Cas de deux sources ponctuelles48
4.2.2 Objet ponctuel illuminé par un système optique50
4.2.3 Profondeur de champ51
4.2.4 Système centré et transformée de Fourier52
4.2.4.1 Définition de la transformée de Fourier52
4.2.4.2 Transformée de Fourier d'une image52
4.2.4.3 Cas des systèmes optiques centrés56
4.3 Aberrations optiques
58
4.3.1 Aberrations chromatiques58
4.3.2 Aberrations géométriques59
4.3.2.1 Aberrations de sphéricité60
4.3.2.2 Aberrations de coma (comète)61
4.3.2.3 Astigmatisme61
4.3.2.4 Distorsion63
4.3.3 Correction des aberrations, objectifs et condenseurs63
4.3.4 Objectifs et condenseurs64
4.3.4.1 Les différents types d'objectifs et de condenseurs64
4.3.4.2 Informations portées sur les bagues des objectifs65
4.3.4.3 Immersion67
4.3.4.4 Grandissement du microscope67
4.4 Contraste et fonction de transfert
68
5 Microscopie à transmission
73
5.1 Plans conjugués
73
5.1.1 Conjugaison des plans des ouvertures73
5.1.2 Conjugaison des plans de champs76
5.2 L'ajustement de Köhler
76
5.3 Rapport ONo/ONc
77
6 Génération de Contraste
79
6.1 Microscopie à contraste de phase
79
6.1.1 Les expériences originales de Zernike79
6.1.2 Le banc optique du microscope à contraste de phase81
6.1.2.1 Le banc optique actuel81
6.1.2.2 Réglage du microscope à contraste de phase81
6.2 Microscopie à contraste interférentiel, DIC
82
6.2.1 Lumière polarisée, anisotropie optique83
6.2.2 Cas particulier des milieux uniaxes88
6.2.3 Système de Wollaston92
6.2.4 Polarisation circulaire93
6.2.5 Principe de la microscopie interférentielle94
6.2.6 Ajustement du microscope de contraste interférentiel96
6.3 Contraste de Hoffmann
97
7 Fluorescence
99
7.1 Quelques notions de physique
100
7.1.1 Absorption de la lumière et fluorescence100
7.1.2 Blanchiment (bleaching)105
7.1.2.1 Principe physique105
7.2 Le banc optique d'un microscope à fluorescence
107
7.2.1 Le «bloc filtre» et le statif d'un épimicroscope107
7.2.2 Le statif109
7.2.3 Ajustement de la lampe111
7.2.3.1 Éclairage de Köhler en épimicroscopie111
7.2.3.2 Éclairage «critique»112
7.2.4 Résolution spatiale et dynamique113
7.3 Fluorescence à deux photons
114
7.3.1 Absorption de plusieurs (deux) photons114
7.3.2 Avantages116
7.3.3 Inconvénients/limitations116
7.4 Quelques microscopies «dynamiques»
117
7.4.1 FRAP117
7.4.2 Polarisation et fluorescence118
7.4.3 Ratio imaging118
7.4.4 Utilisation de fluorochromes photoactivables119
7.4.5 La microscopie de FRET120
7.4.6 La microscopie de FLIM121
7.4.7 La microscopie de deuxième harmonique122
7.4.8 Microscopie de surface, ondes évanescentes123
7.4.9 La microscopie FSM et FCS124
8 Lampes et LASER
125
8.1 Quelques rappels de physique
125
8.2 Les lampes à incandescence
126
8.3 Les tubes à décharge (émission spontanée)
128
8.4 Les tubes LASER (émission stimulée)
129
8.4.1 Peuplement de l'état E2, pompage optique130
8.4.2 Désexcitation de l'état E2131
9 Le microscope confocal
135
9.1 Principes fondateurs de la microscopie confocale
135
9.1.1 Un peu d'histoire135
9.1.2 Balayages et couplage des balayages en transmission137
9.1.3 Des «trous d'épingle»138
9.2 Schéma d'un épimicroscope confocal
140
9.2.1 Microscopie de fluorescence140
9.2.2 Microscopie confocale à vision directe141
9.3 Résolution du microscope confocal
144
9.3.1 Cinq paramètres essentiels144
9.3.2 Définition spatiale de la «sonde optique»145
9.3.3 Limite de Nyquist, fréquence d'échantillonnage148
9.3.4 Résolution et loi de Snell-Descartes152
9.3.5 Rapport des longueurs d'ondes155
10 Imagerie numérique
157
10.1 Qu'est ce qu'une image numérique ?
157
10.1.1 Numérisation et discrétisation157
10.1.2 Discrétisation des dimensions «x, y» de l'image158
10.1.2.1 Principe de la numérisation158
10.1.2.2 Numérisation des coordonnées dans le plan159
10.1.3 Numérisation de la luminance locale observée «g»160
10.1.4 Le capteur CCD et son bruit161
10.1.4.1 A propos du rendement quantique162
10.1.4.2 Convertisseur analogiqueVecteurnumérique164
10.1.4.3 Convertisseur numériqueVecteuranalogique165
10.2 «Signal», «bruit» et «bruit de fond»
167
10.3 Quelques remarques et quelques conseils
169
10.3.1 Saisie des images témoins169
10.3.2 Mesures absolues et mesures relatives170
10.3.3 Résolution spatiale et résolution de dynamique170
10.3.4 To be (co-distributed) or not to be (co-distributed)172
10.3.4.1 Recalage des images172
10.3.4.2 Quid de la perception des couleurs ?173
10.3.4.3 Capteur «noir et blanc» et capteur «couleur»178
10.4 Microscopie «bas niveau»
179
10.4.1 L'exemple du ciel étoilé et de la Lune180
10.4.2 Ajustement du microscope, grossissement180
10.4.3 Propriétés de la rétine182
11 Quelques exemples
187
11.1 Qu'est-ce qu'une bonne image numérique ?
187
11.2 Premier exemple
190
11.3 Deuxième exemple
194
11.4 Une alternative efficace : la «segmentation»
196
11.5 Saisie «couleur» ou saisie «noir et blanc» ?
198
12 Index
199